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purification:tev:b_protocol

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purification:tev:b_protocol [2016/07/13 15:47] – created bonnefonpurification:tev:b_protocol [2023/11/01 20:19] (current) – external edit 127.0.0.1
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 ==== 1. Culture ==== ==== 1. Culture ====
-  * +
   * Electrotransformation BL21(DE3) avec plasmide pTEV    * Electrotransformation BL21(DE3) avec plasmide pTEV 
-  * Etalement sur boite LB agar + Kanamycine 30 µg/ml+  * Etalement sur boite LB agar + Kan 30 µg/ml
   * Quelques colonies prélevées pour ensemencer préculture de 100 ml de LB + kanamycine 30 µg/ml   * Quelques colonies prélevées pour ensemencer préculture de 100 ml de LB + kanamycine 30 µg/ml
-  * Il est important :  +  * Culture de 3 x 1 litre de LB Kan 30 µg/ml ensemencée avec la préculture pour avoir DO initiale de 0.1
-   * que la boite de transformation soit récente (2 jours max.) +
-   * de prendre plusieurs colonies pour préculture +
-   * d'avoir 100 ml de préculture pour ne pas avoir une préculture trop dense +
- +
-  * Culture de 3 x 1 litre de LB kanamycine 30 µg/ml ensemencée avec la préculture pour avoir DO initiale de 0.1+
   * Culture à 37°C pendant environ 2h puis à 16°C jusqu'à DO de 0.5 et ajouter 1 mM IPTG final    * Culture à 37°C pendant environ 2h puis à 16°C jusqu'à DO de 0.5 et ajouter 1 mM IPTG final 
   * Induction pendant 4h à 16°C   * Induction pendant 4h à 16°C
   * Centrifugation et lavage culots avec tampon A((20 mM HEPES-NaOH pH 8.2, 1 M KCl, 30 mM imidazole))   * Centrifugation et lavage culots avec tampon A((20 mM HEPES-NaOH pH 8.2, 1 M KCl, 30 mM imidazole))
 +
 +
 +**Il est important** : 
 +   * que la boite de transformation soit récente (2 jours max.)
 +   * de prendre plusieurs colonies pour préculture
 +   * d'avoir 100 ml de préculture pour ne pas avoir une préculture trop dense
  
 ==== 2. Purification ==== ==== 2. Purification ====
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 === 2.1 Extraction (Jour 1) === === 2.1 Extraction (Jour 1) ===
  
-Culots 3 l + 60 ml tampon A + 2 mM β-ME + 0.1 % Triton X-100 + PIC + benzonase. +  * Culots 3 l + 60 ml tampon A + 2 mM β-ME + 0.1 % Triton X-100 + PIC + benzonase. 
-Sonication 2 minutes totales +  * Sonication 2 minutes totales 
-Centrifugation 30 min 15,000 rpm à 4°C +  * Centrifugation 30 min 15,000 rpm à 4°C 
  
-=== 2.2 Ni-Sepharose HighTrap 5 ml (Jour1) ===+=== 2.2 Ni-Sepharose High-Trap 5 ml (Jour1) ===
  
   * Colonne équilibrée tampon A   * Colonne équilibrée tampon A
purification/tev/b_protocol.1468424846.txt.gz · Last modified: (external edit)