====== Culture et purification TEV ======


==== 1. Culture ====

  * Electrotransformation BL21(DE3) avec plasmide pTEV 
  * Etalement sur boite LB agar + Kan 30 µg/ml
  * Quelques colonies prélevées pour ensemencer préculture de 100 ml de LB + kanamycine 30 µg/ml
  * Culture de 3 x 1 litre de LB Kan 30 µg/ml ensemencée avec la préculture pour avoir DO initiale de 0.1
  * Culture à 37°C pendant environ 2h puis à 16°C jusqu'à DO de 0.5 et ajouter 1 mM IPTG final 
  * Induction pendant 4h à 16°C
  * Centrifugation et lavage culots avec tampon A((20 mM HEPES-NaOH pH 8.2, 1 M KCl, 30 mM imidazole))


**Il est important** : 
   * que la boite de transformation soit récente (2 jours max.)
   * de prendre plusieurs colonies pour préculture
   * d'avoir 100 ml de préculture pour ne pas avoir une préculture trop dense

==== 2. Purification ====

=== 2.1 Extraction (Jour 1) ===

  * Culots 3 l + 60 ml tampon A + 2 mM β-ME + 0.1 % Triton X-100 + PIC + benzonase.
  * Sonication 2 minutes totales
  * Centrifugation 30 min 15,000 rpm à 4°C 

=== 2.2 Ni-Sepharose High-Trap 5 ml (Jour1) ===

  * Colonne équilibrée tampon A
  * Charge surnageant
  * Voie A1 : tampon A (step lavage)
  * Voie B1 : A + 60 mM imidazole (step lavage)
  * Voie A2 : tampon A + 50 mM EDTA (step élution)

Analyse sur gel 15 % (TEV migre à environ 30 kDa)
Peu de contaminants sortent avec la TEV mais pas de deuxième étape de purif car la TEV est fragile

=== 2.3 Dialyse (Jour 1) ===
  * 
  * Dialyse de la  TEV contre  500 ml de 50 mM Tris-HCl pH 7.5, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0.1 % Triton de 2-3 h
  * Dialyse O.N. 4°C contre  500 ml de 50 mM Tris-HCl pH 7.5, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0.1 % Triton, 50 % glycérol

=== 2.4 Dosage et aliquots (Jour 2) ===

  * Dosage Bradford du dialysat TEV
  * Pas de concentration nécessaire mais dilution possible
  * Aliquots de TEV de 1 ml à 1 mg/ml dans Eppendorf sur la glace et stockage le plus rapidement possible à -80°C pour ne pas perdre l'activité enzymatique.