Culture et purification TEV

• Electrotransformation BL21(DE3) avec plasmide pTEV
• Etalement sur boite LB agar + Kan 30 µg/ml
• Quelques colonies prélevées pour ensemencer préculture de 100 ml de LB + kanamycine 30 µg/ml
• Culture de 3 x 1 litre de LB Kan 30 µg/ml ensemencée avec la préculture pour avoir DO initiale de 0.1
• Culture à 37°C pendant environ 2h puis à 16°C jusqu'à DO de 0.5 et ajouter 1 mM IPTG final
• Induction pendant 4h à 16°C
• Centrifugation et lavage culots avec tampon A¹⁾

Il est important :

• que la boite de transformation soit récente (2 jours max.)
• de prendre plusieurs colonies pour préculture
• d'avoir 100 ml de préculture pour ne pas avoir une préculture trop dense

• Culots 3 l + 60 ml tampon A + 2 mM β-ME + 0.1 % Triton X-100 + PIC + benzonase.
• Sonication 2 minutes totales
• Centrifugation 30 min 15,000 rpm à 4°C

• Colonne équilibrée tampon A
• Charge surnageant
• Voie A1 : tampon A (step lavage)
• Voie B1 : A + 60 mM imidazole (step lavage)
• Voie A2 : tampon A + 50 mM EDTA (step élution)

Analyse sur gel 15 % (TEV migre à environ 30 kDa) Peu de contaminants sortent avec la TEV mais pas de deuxième étape de purif car la TEV est fragile

• Dialyse de la TEV contre 500 ml de 50 mM Tris-HCl pH 7.5, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0.1 % Triton de 2-3 h
• Dialyse O.N. 4°C contre 500 ml de 50 mM Tris-HCl pH 7.5, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0.1 % Triton, 50 % glycérol

• Dosage Bradford du dialysat TEV
• Pas de concentration nécessaire mais dilution possible
• Aliquots de TEV de 1 ml à 1 mg/ml dans Eppendorf sur la glace et stockage le plus rapidement possible à -80°C pour ne pas perdre l'activité enzymatique.